Ядерная ламина; структура и функции. Ламинопатии Избегайте скучных выводов

11 Июля 2008

Проблема генетического контроля продолжительности жизни и процесса старения имеет много граней, одна из них высветилась при изучении наследственных заболеваний, входящих в группу ламинопатий. Ламинопатии представляют собой группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в генах, кодирующих белки ядерной ламины, которая входит в состав оболочки ядра клетки и играет важную роль в поддержании её ригидности.

Ядерная оболочка включает двухслойную ядерную мембрану, состоящую из наружного и внутреннего слоёв, комплекса ядерных пор и ядерной ламины, находящейся под поверхностью внутренней мембраны ядра. Первоначально ламину обнаружили в виде фиброзного компонента ядра, состоящего из филаментов, соответствующих по размеру промежуточным филаментам (10-13 нм) [промежуточные филаменты (intermediate filaments – IF) являются элементами цитоскелетных структур многоклеточных и встречаются как в цитоплазме, так и в ядре]. Структурные особенности филамент ламины определяются образующими их белками, названных ламинами.

Ламины относятся к суперсемейству белков IF, 5-ая группа (остальные 4 группы являются цитоплазматическими) и, благодаря своим структурным особенностям, способны претерпевать посттрансляционную модификацию. Число белков ламинов, обнаруженных у различных многоклеточных, варьирует. У человека (и других млекопитающих) имеется 3 гена, которые кодируют 7 различных белков. Эти белки разделят на два типа – А-тип и В-тип, которые различаются по генетическому контролю, способу синтеза, характеру экспрессии и другим особенностям (таблица 1 – по C.J. Hutchison, 2002 с изменениями).

Тип ламина				Экспрессия
	A, AD10 * , C	LMNA	Альтернативныйсплайсинг	Дифференцированные клетки
		LMNA	Альтернативныйсплайсинг	Зародышевая линия (спермоспецифичная экспрессия)
		LMNB 1	Продукт гена LMNB 1	Большинство клеток
		LMNB2	Альтернативныйсплайсинг	Большинство клеток
		LMNB2	Альтернативныйсплайсинг	Только в сперматоцитах

* - этот ламин был обнаружен также и в некоторых линиях опухолевых клеток.

[Альтернативный сплайсинг – это контролируемая "перекройка" молекул матричных РНК (мРНК), считанных с одного гена, сопровождается соединением экзонов гена в разных комбинациях с образованием различных зрелых молекул мРНК, это обеспечивает кодирование одним геном различных конечных продуктов и является одним из основных механизмов порождения белкового разнообразия у высших эукариот.]

Экспрессия ламинов В1 и В2 наблюдается в большинстве клеток как у эмбрионов, так и у взрослых организмов. От них зависит целостность ядра, выживание клеток и нормальное развитие. Ламины типа А имеют иной характер экспрессии, который коррелирует с дифференцировкой клеток. Благодаря этому возникло предположение, что ламины В-типа определяют жизнеспособность организма в то время, как ламины типа А имеют более специализированные функции. Имеются доказательства об участии ламинов в процессах транскрипции и пост-транскрипционном процессинге РНК.

В последнее десятилетие обнаружена связь мутаций в LMNA с целым рядом клинически разнообразных болезней, которые объединяют в группу ламинопатий. Активизация исследований в этом направлении привела к значительному всплеску публикаций: только в 2005 году их число превысило 200. При ламинопатиях наблюдают нарушения, приводящие к изменению структуры поперечно-полосатых мышц и ожирению, к полинейропатии, липодистрофии, кардиомиопатии, способствующие развитию резистентности к инсулину, кожным нарушениям и т.д.

Но наиболее драматическим фенотипом, вызываемым мутациями в LMNA и последующим нарушением сплайсинга, является прогерия, или синдром преждевременного старения – синдром Хатчинсона-Гилфорда. Присутствие в клеточном ядре дефектного ламина приводит ко множеству патологических изменений: резко снижается в ядре содержание ряда белков, ядерная оболочка сморщивается, нарушается процесс репарации ошибок, возникающих при синтезе ДНК. В итоге клетки теряют способность делиться, не происходит замещение погибших клеток новыми, что приводит к преждевременному старению организма. Эти больные не доживают до 20 лет и имеют уже в10-12 лет вид маленьких древних стариков.

Настоящим бумом явилось сообщение P. Scaffidi и T. Misteli в журнале Science (2006), которые показали, что ген LMNА имеет самое непосредственное отношение не только к развитию синдрома прогерии, но и к процессу «нормального» (не ускоренного - физиологического) старения. Учёные обнаружили, что неправильный сплайсинг ламиновой информационной РНК происходит не только у больных прогерией, но и у здоровых людей, но со значительно меньшей частотой. Хотя количество дефектного ламина с возрастом не возрастает, но со временем (у пожилых людей) в клетках наблюдаются изменения, аналогичные таковым у больных прогерией. В эксперименте на фибробластах, взятых у старых людей, было показано, что подавление неправильного сплайсинга приводило к омоложению клеток.

В экспериментальном исследовании на животных, проводимом группой учёных из США и Швеции под руководством L.G. Fong, было показано, что для нормального функционирования оболочек ядра и предотвращения преждевременного старения организма, прежде всего, обязательно присутствие ламина С.

В сообщении группы учёных из Массачусетского университета (июль 2007) представлен интересный факт: мутации гене LMNB1 приводили к тому, что ось ядра в клетках меняла своё положение и в результате наблюдали вращение ядер. На подвижность цитоскелета эти мутации не влияли. Если в клетках мышей LMNB1 -/- исследователи экспрессировали кДНК дикого типа, то вращение ядер прекращалось. По предположению учёных ламин В1, возможно, выполняет якорную функцию, обеспечивая связь оболочки ядра с цитоскелетом. Мыши, дефектные по гену LMNB1 погибали на ранней стадии развития.

Таким образом, к настоящему моменту получены очень интересные и интригующие данные, указывающие на фундаментальное значение генов, контролирующих структуру и функцию ламинов. Однако влияние ламинов на жизнедеятельность и функционирование организма в целом ещё остаётся мало понятной и требует дальнейшего изучения. Возможно, это приведёт к обнаружению новых возможностей борьбы со старостью и откроет реальные пути к активному долголетию.

назад

Читать также:

05 Июня 2008

Всего один ген – и целая куча болезней

Уникальность белка XPD, необходимого для восстановления повреждений ДНК, заключается в том, что мутации в разных участках его гена лежат в основе трех заболеваний.

читать 21 Мая 2008

В США открыли национальную программу по изучению безымянных болезней

Национальные институты здравоохранения США начинают программу по работе с пациентами, чьи заболевания столь редки, что до сих пор не имеют даже названия

читать 27 Февраля 2008

Отсеять мутантов

Организм высшего животного способен чрезвычайно эффективно избавляться от мутантных митохондрий: они исчезают уже через 2–6 поколений. Отбор нормальных митохондрий происходит женских половых клеток или на субклеточном уровне.

читать 08 Февраля 2008

Наследственные болезни: выявить можно уже сейчас, вылечить – еще не скоро

До недавнего времени были изучены преимущественно моногенные заболевания, возникающие при нарушении работы одного гена. Но большинство наследственных болезней связаны с одновременным нарушением работы нескольких генов и определённым воздействием внешней среды.

читать 28 Августа 2007

Гены шизофрении ищут в горах

Ученые из группы генетической адаптации человека Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН пытаются идентифицировать гены, отвечающие за хронические заболевания, десятилетиями изучая представителей коренных народов Дагестана. В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на генах, которые предопределяют возникновение шизофрении.

читать 08 Июля 2008

Избегайте скучных выводов

Нобелевский лауреат, которому исполнилось 80 лет, подчеркнул, что он никогда не терял интереса к науке. При этом, к удивлению многих, Уотсон заявил, что практически не занимался ею все те годы, пока руководил лабораторией.

Разрыв Договора о ракетах средней и меньшей дальности (ДРСМД) повысит риск начала ядерного конфликта, заявил Сергей Лавров. По словам главы МИДа, Россия ответит на выход США из соглашения военно-техническими средствами

Сергей Лавров (Фото: Владимир Астапкович / РИА Новости)

Выступая в университете в столице Киргизии, глава российского внешнеполитического ведомства прокомментировал решение Вашингтона начать выход из ДРСМД, сообщает «РИА Новости» . По словам министра, речь идет наступлении новой эпохи, когда США «взяли курс на слом всей системы контроля над вооружениями».

Упоминал Лавров и о планах Соединенных Штатов по созданию ядерных боеприпасов малой мощности. По его словам, все это понизит порог применения ядерного оружия и повысит риски возникновения конфликта.

Российский министр предположил, что результатом случившегося станут развитие холодной войны и гонка вооружений. Однако Москва будет реагировать на возникающие угрозы «военно-техническими средствами».

Что касается перспектив российско-американского диалога по стратегической стабильности, Лавров выразил надежду, что «Соединенные Штаты дозреют до понимания своей ответственности за создаваемые их политикой проблемы. «Тогда милости просим, двери открыты, будем разговаривать на равных, на основе учета законных интересов друг друга, а не выдуманных», — сказал министр.

Россия ответила на действия американских властей . Президент Владимир Путин объявил о приостановке участия в договоре на встрече с Лавровым и министром обороны Сергеем Шойгу. При этом глава государства подчеркнул, что Россия не намерена втягиваться в затратную для Москвы гонку вооружений.

Поводом для решения США стала российская крылатая ракета ​9М729, запуск которой осуществляется с помощью пусковых установок «Искандер-М». Американские власти потребовали приостановить разработку этой ракеты, обвинив Россию в нарушении ДРСМД. В Москве эти обвинения отрицают. Сергей Лавров заявил, что американская сторона начала нарушать договор с 1999 года, когда США начали испытывать боевые беспилотные летательные аппараты.

Договор о ракетах средней и меньшей дальности был подписан между США и СССР в 1987 году. Он запрещает испытывать, производить и ставить на вооружение ракеты наземного базирования меньшей (от 500 до 1 тыс. км) и средней дальности (от 1 тыс. до 5,5 тыс. км). Стороны обязались также в течение трех лет после подписания ДРСМД уничтожить уже стоявшие на вооружении подобные ракетные комплексы. Выход из договора позволяет вернуться к разработке и производству такого вооружения.

Ядерная ламина состоит из белков промежуточных филаментов, называемых ламинами
Ядерная ламина расположена за внутренней ядерной мембраной и физически связана с ней интегральными мембранными белками
Ядерная ламина участвует в сборке ядерной оболочки и может выполнять функции ее физической поддержки
Ядерная ламина связана с хроматином посредством белков. Это может обусловливать ее роль в репликации и транскрипции ДНК
У дрожжей и некоторых других одноклеточных эукариот ядерная ламина отсутствует

Наличие - сети промежуточных филаментов, расположенной за внутренней ядерной мембраной, является характерным признаком, свойственным ядрам клеток Metazoa. Как показано на рисунке ниже, ламина легко выявляется методом непрямой иммунофлюоресценции, с использованием антител к одному из белков, входящих в ее состав.

В электронном микроскопе ламина выглядит как сеть, состоящая из отдельных волокон. На рисунке также представлены типичные неупорядоченные филаменты ламины, расположенные прямо за внутренней ядерной мембраной.

Белки ядерной ламины (называемые ламины) напоминают кератиновые белки промежуточных филаментов цитоплазмы. Так же как и кератины, они называются белками промежуточных филаментов, поскольку образуемые ими филаменты (10-20 нм) по размеру занимают промежуточное положение между актиновыми микрофиламентами (7 нм) и микротрубочками (25 нм). Целостность филаментов ламины нарушается ЯПК, которые прикрепляются к ней.

Наряду с белками промежуточных филаментов, ядерная ламина также содержит набор интегральных мембранных белков, которые называются белками, связанными с ламиной (LAP). Некоторые из этих белков участвуют во взаимодействиях между ламиной и внутренней мембраной ядра. Как показано на рисунке ниже, ламина закрепляется на внутренней ядерной мембране двумя типами связей. Один тип образуется между белками ламины и интегральными белками внутренней мембраны ядра Другой тип возникает при взаимодействии полипептидной цепи ламинов с липидной фарнезильной группой внутренней ядерной мембраны.

Для визуализации ядерной ламины с помощью флуоресцентной микроскопии использовали антитела к белкам ламины (в рамке).
На фотографии, полученной с помощью электронного микроскопа, видны ядерные корзины ядерных поровых комплексов (ЯПК) и филаменты ядерной ламины.

Геном растений не содержит генов ядерных ламинов , однако растения содержат другие структурные белки, которые выполняют такие же функции, как и ламины клеток млекопитающих. Дрожжи (S. cerevisiae и S. pombe) и некоторые другие одноклеточные эукариоты не содержат ламинов, и поэтому не образуют ламины. С чем это может быть связано?

Существуют, по меньшей мере, две возможные причины , объясняющие отсутствие ламины у одноклеточных различием в величине ядер у клеток дрожжей (около 1 мкм в диаметре) и многоклеточных организмов (порядка 10 мкм в диаметре). Первая возможность заключается в том, что для дрожжевых клеток характерен закрытый митоз, при котором ядерная оболочка в течение всего времени остается интактной. Напротив, в клетках многоклеточных эукариот ядерная оболочка разрушается в начале митоза. После сегрегации хромосом вокруг каждого их набора образуется новая ядерная оболочка. Считается, что в это время ламина играет главную роль в перестройке организации ядра.

Во-вторых, ламина может обеспечивать дополнительную структурную поддержку для более крупной ядерной оболочки в клетках Metazoa.

Наряду с той ролью, которую ядерная ламина выполняет в сборке и поддержании структуры ядра, ее взаимодействие с хроматином может представляться необходимым для протекания репликации ДНК. Данные, свидетельствующие о роли ядерной ламины в репликации, были получены в экспериментах, в которых хроматин сперматозоидов Xenopus laevis добавляли к экстрактам яйцеклеток. При этом вокруг хроматина отмечалось образование ядерной оболочки.

Эти ядра увеличивались в размерах, и происходила деконденсация хромосом , находившихся в ядрах сперматозоидов в конденсированном состоянии (деконденсация маскирует картину, которая наблюдается при оплодотворении, когда ДНК сперматозоида взаимодействует с некоторыми факторами в ооцитах). Затем в этих ядрах происходит репликация ДНК. В экстрактах яйцеклеток в большом количестве содержатся ядерные ламины и LAP.

После удаления ламины из этих экстрактов с помощью иммобилизованных антител к белкам ламины формирование ядерной оболочки вокруг хроматина сперматозоидов еще возможно. Однако ядра маленькие и хрупкие, и репликации ДНК в них не происходит. Эти результаты свидетельствуют о том, что ламина может играть важную роль в организации хроматина и репликации ДНК.

Повышенная хрупкость клеток связана с мутациями , затрагивающими белки промежуточных филаментов. Мутации в ламинах и LAP обусловливают развитие ряда генетических заболеваний, особенно поражающих мышечную систему. Эти заболевания называются ламинопатиями. По-видимому, изменения ламины придают ядру хрупкость и большую чувствительность к повреждениям. Особенно склонны к повреждениям мышечные клетки, поскольку при сокращении мышц ядра их клеток испытывают большую механическую нагрузку, чем ядра клеток других тканей.

Ядерная ламина сцеплена с внутренней ядерной мембраной двумя типами связей. Когда у сперматозоидов Xenopus laevis удаляют плазматическую мембрану и инкубируют их с экстрактом яйцеклеток,
происходит деконденсация хроматина и вокруг него образуется функционально-активная ядерная оболочка.
Флуоресценция обнаруживает локализацию ДНК. Результаты этапа: 1) Анализ содержания ламина А и ламина В в ядерной оболочке клеток отобранных на первом этапе работы линий (Ras-трансформированные фибробласты хомяка с разным метастатическим потенциалом). Во всех клеточных линиях антитела к обоим ламинам ярко окрашивают ядра. У клеток HET-SR (низкометастазирующие) ядра имеют правильную форму, ламин А выявляется и в ядерной оболочке, и в нуклеоплазме, ламин В ярче в основном присутствует в оболочке ядра. У всех высокометастазирующих линий клеток наблюдается большое разнообразие форм ядер, а также образование складок или неравномерных скоплений ламинов (рис. 1). У спонтанно трансформированных клеток, у которых трансформация произошла в результате длительного культивирования in vitro линии эмбриональных клеток сирийского хомяка (ST-HET – низкометастазирующие клетки, ST-HET клон 83/20 – высокометастазирующие клетки) наблюдались сходные изменения – при отсутствии достоверной разницы в интенсивности окрашивания ламинов А и В между низко- и высокометастатическими линиями была отмечена большая изменчивость форм ядер у высокометастатической линии ST-HET clone 83/20 и неравномерное распределение обоих ламинов (рис.2). Вестерн-блот-анализ экспрессии ламинов также не показал существенного различия в содержании ламинов А и В между низко и высокометастазирующими клетками (рис.3). Поскольку различия в метастатической активности in vivo могут зависеть от активности матриксных металлопротеаз, был проведен зимографический анализ в исследуемых линиях. Для этого рассаживали клетки на 35 мм чашки Петри в концентрации 150000 клеток на чашку, культивировали 1 сутки, потом 3 раза отмывали средой без сыворотки и оставляли в бессывороточной среде на 12 часов и собирали кондиционированную среду. После этого подсчитывали количество клеток в чашках для нормирования нанесения белка при исследовании активности металлопротеиназ. Для анализа желатиназной активности матриксных металлопротеаз 10 мкл аликвоты кондиционированной среды смешивали с 10 мкл буфера для нанесения белков для зимографии и наносили на гель. Проводился стандартный SDS-ПААГ электрофорез в стандартных условиях в 8% полиакриламидном геле, содержащем 0,2% желатина, осуществляли ренатурацию в течение 30 мин и проводили желатиназную реакцию в течение 4 часов. Для всех исследованных линий быявлялась активность металлопротеиназы 2, однако достоверных различий в активности металлопротеиназ между низко и высокометастатическими клетками обнаружено не было (рис.4). Таким образом, различия в метастатическом потенциале клеток сирийского хомяка при разных способах трансформации вызвано не изменением содержания ламина А или ламина В, но ассоциировано с изменением формы ядер и распределения ламинов, что указывает на возможные нарушения как в таргетинге ламинов во внутреннюю ядерную мембрану, так и в регуляции сборки микродоменов ламинов. 2) Анализ миграционной активности клеток в ограниченном пространстве. Миграционную активность клеток в зависимости от уровня экспрессии ламина А и его сплайс-вариантов проводили в камерах Бойдена с диаметром пор 3 и 8 мкм. Для создания градиента хемоаттрактанта в нижнюю камеру добавляли эмбриональную сыворотку, клетки в верхней камере инкубировали в бессывороточной среде (рис.5). Анализ проводили на клеточных популяциях линии HT1080 (фибросаркома человека), гетерогенных по уровню экспрессии GFP-ламина А и GFP-прогерина, а также клетках с нокдауном ламина А (уровень нокдауна в индивидуальных клетках пропорционален флуоресценции GFP, коэкспрессирующегося со шпилечной РНК против ламина А). Анализ эффективности миграции осуществляли на следующие сутки после посева при помощи высокопроизводительного микроскопического скрининга и автоматической детекции количества клеток с надпороговым уровнем сигнала GFP с обеих сторон мембраны с использованием алгоритмов, оптимизированных на предыдущем этапе выполнения проекта. Результаты анализа показали, что доля клеток, экспрессирующих как экзогенный ламин А, так и прогерин, существенно снижена в популяции клеток, мигрировавших через поры, что свидетельствует о торможении миграции (рис.6). Данный эффект зависит от размера пор: эффективность миграции через 8-мкм поры снижается на 25% и 32% для ламина А и прогерина, соотвественно, а при миграции через 3-мкм поры, эффективность снижалась еще существеннее - на 61% и 66%. В то же время подавление экспрессии ламина А не приводит к активации миграции (рис.7). По-видимому, поскольку в данных исследованиях использовались трансформированные клетки с изначально высоким миграционным потенциалом и высокой пластичностью ядерной оболочки, дополнительное снижение уровня ламина А не вносит существенного вклада в способность клеток мигрировать через поры. Поэтому на следующем этапе экспериментов планируется использовать описанные в предыдущем отчете линии HSR, демонстрирующие разные возможности к метастазированию (инвазии в ткани организма), а также их трансгенные варианты. 3). Для исследования миграции клеток в 3D коллагеновом геле совместно в компанией PhaseView был разработан оптимизированный алгоритм регистрации изображений методом микроскопии планарного освещения (SPIM). Данный алгоритм и его аппаратная имплементация обеспечивают трехмерную световую микроскопию планарного освещения (SPIM) с лазерным световым листом с повышенной однородностью и глубиной распространения по всему полю зрения в прозрачных и полупрозрачных образцах от среднего до крупного размера. В частности, в этой системе предусмотрены средства для поддержания минимальной толщины лазерного светового листа внутри объекта на максимально возможной для данной оптической конфигурации площади, что обеспечивает равномерное и максимально возможное аксиальное разрешение по всему полю зрения. В основе системы лежит синхронизация скорости и фазы Rolling shutter КМОП-камеры, используемой для регистрации изображений, с перемещением седловины лазерного листа при помощи адаптивной оптики, установленной в оптическом пути возбуждения (рис. 8). Система была специально адаптирована для анализа миграции клеток в трехмерном геле, поскольку SPIM-микроскопия обеспечивает пониженную фототоксичность и существенно более высокую скорость захвата изображения по сравнению с лазерной конфокальной микроскопией с поточечным сканированием, что позволяет проводить длительные прижизненные наблюдения, анализируя при этом существенно больший объем образца с высоким пространственным и временным разрешением (рис.9). Данная система будет в дальнейшем использована для анализа влияния ингибирования Zmpste24 на миграционную активность раковых клеток в 3D-гелях. 4) Влияние экспрессии экзогенных ламина А и прогерина на механические свойства ядерной оболочки в живых клетках анализировали при помощи сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM). Данный метод, помимо возможности высокоскоростного сканирования рельефа поверхности живых культивируемых клеток с высоким латеральным и аксиальным разрешением, позволяет измерять эластические свойства клеток (рис.10а,б). Измерение коэффициентов упругости ядра также возможно благодаря незначительному по толщине слою цитоплазмы над ядром клетки, распластанной на стеклянной подложке. Для минимизации вклада цитоплазмы в определяемые параметры ядра использовались клетки фибросаркомы человека HT1080, демонстрирующие высокую степень распластывания. Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-ламин А или GFP-прогерин. Измерения проводили на приборе МНТ (ООО «Медицинские нанотехнологии»), установленном на инвертированной флуоресцентной платформе Eclipse Ti2 (Nikon) на второй день после трансфекции. В качестве сканирующего элемента использовались стеклянная микропипетка на пьезоконтроллере (Рис. 10,а). Клетки для сканирования выбирали по уровню флуоресценции в канале GFP. Сначала проводили сканирование рельефа исследуемой клетки. В данном случае детекция поверхности происходит, когда при достижении ее границы стеклянной микропипеткой сила ионного тока падает на ~0,25-1%. Далее осуществлялось определение эффективной жесткости, вычисляемое из регистрируемого конечного смещения мембраны после продавливания ее ионным током, при этом определяется следующая точка падения ионного тока на ~1%. Клетка сканировалась целиком, далее определялось положение ядра по самой высокой точке на рельефе. В этой области для обработки брались 10 точек, значение жесткости для еще 10 точек выбирались по периферии клетки, при этом эти точки не должны были находиться совсем вблизи края цитоплазмы, чтобы в выборку не попали значения жесткости подложки (рис. 10,в). Результаты измерений упругости ядра нормировали на упругость цитоплазмы в области ламеллы. В ряде экспериментов измерения проводили на фоне разборки актинового и тубулинового цитоскелета (под действием нокодазола и цитохалазина D), степень разборки оценивали при помощи иммуноокрашивания клеток антителами против бета-тубулина или прижизненной окраски SIR-актином. Предварительные результаты показали прямую корреляцию между концентрацией экзогенного GFP-ламина А в ядре и жесткостью клеточного ядра (рис.11). Исследования будут продолжены для оптимизации метода (подбор диаметра капилляра, модификация алгоритмов расчета жесткости и т. д.) с целью повышения точности измерений, увеличения размеров выборки, а также для исследования эффективности ингибиров Zmpste24. 5). Исследование влияния экспрессии прогерина на структурную организацию и позиционирование периферического гетерохроматина проводили на модели клеточных линий китайского хомячка (CHO), в геном которых бы интегрирован искусственный хромосомный локус, содержащий множественные тандемные повторы Lac-оператора. Визуализацию локусов осуществляли при помощи экспрессируемого в клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al, 1996). В работе использовали клон AO_3, содержащий амплифицированный искусственный локус (HSR), демонстрирующий высокую степень гетерохроматинизации и перманентно ассоциированный с ядерной ламиной (Li et al, 1998; Жиронкина и др., 2014). Клетки CHO AO_3 трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-прогерин, через 48 часов клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против ламина А для дифференцирования сигналов GFP-Lac-репрессора и GFP-прогерина. Иммунофлуоресцентная микроскопия и микроскопия с суперразрешением показали, что экспрессия прогерина не вызывает уменьшения степени компактизации, оцениваемого по изменениям площади HSR или средней интенсивности флуоресценции GFP в нем (рис. 12). Также не наблюдалось значительных изменений в позиционировании HSR относительно ядерной оболочки: в клетках с высоким уровнем экспрессии прогерина выявляется типичная для прогерии Хатчисона-Джилфорда лобулярная структура ядра и образование многочисленных инвагинаций ядерной оболочки, и HSR всегда остается ассоциированным либо с ядерной периферией, либо с ламинов в области инвагинаций. Для исследования ультраструктурной организации хроматина в клетках, экспрессирующих GFP-прогерин, была использована иммуноэлектронная микроскопия с антителами против GFP с последующей Ag-амплификацией сигнала вторичных Nanogold-меченых антител. Такой подход позволил идентифицировать трансфицированные клетки на светооптическом уровне в при помощи светлопольной оптической микроскопии и эффективно находить их на ультратонких срезах. Эдектронно-микроскопический анализ показал, что как искусственные хромосомные локусы, так и эндогенные гетерохроматические района хромосом, вопреки высказанным ранее гипотезам, сохраняют свою конденсированную структуру. Однако при этом часто наблюдается утрата ассоциации периферического гетерохроматина с ядерной ламиной и перемещение его во внутренние районы ядра (Рис. 13, а). Значительные участки ядерной ламины в этих условиях остаются свободными от контактов с гетерохроматином (рис.14). 6). Выявление круга наиболее перспективных конкурентных ингибиторов при использовании методов молекулярного моделирования, дальнейшее изучение стабильности фермент-ингибиторных комплексов методами молекулярной динамики с целью отбора кандидатных соединений для экспериментального исследования Для ZMPSTE24 структурная информация определена кристаллографическими данными рекомбинантного человеческого фермента и белка из Saccharomyces cerevisiae Ste24p. При этом известна только одна структура комплекса ZMPSTE24 с одним из ингибиторов растворимых цинк-зависимых металлопротеаз, обеспечивающих слабое конкурентное ингибирование ZMPSTE24, – фосфарамидоном, характеризующаяся низкими показателями разрешения кристаллографического метода. Несмотря на схожесть активного центра ZMPSTE24 с некоторыми цинк-зависимыми металлопротеазами, как например термолизин и неприлизин, связывание фосфорамидона обеспечивалось на значительно более низком уровне. Т.к. эксперименты проводились in vitro прямых доказательств эффективности данного класса ингибиторов в качестве лекарств не выявлено. Ожидание эффективности действия in vivo на данный момент не подкреплено какими-либо методами, более того, доставка подобных соединений может быть затруднена сложным входом в активный центр ZMPSTE24, образованным интерфейсом взаимодействия фермент-липид-вода, как было описано нами в ходе предыдущего этапа работы в 2017 году. С другой стороны, обнаружено, что класс молекул, применяемых в антиретровирусной терапии пациентов с ВИЧ, может вызывать у них липодистрофию, как результат нецелевого связывания этих молекул с ZMPSTE24. При этом наиболее эффективным образом показал себя лопиновир, для которого экспериментально показан конкурентный механизм ингибирования ZMPSTE24. Ввиду описанных ограничений применение классической схемы in silico скрининга библиотек химических соединений, как правило, представляющей собой перебор большого количества случайных или синтезированных на данный момент структур органических молекул и их последующий докинг в статическую кристаллографическую структуру ZMPSTE24, видится малоэффективным. Структура ZMPSTE24 представляет собой довольно уникальную форму, образованную семи трансмембранными спиралями, охватывающими заполненную водой внутреннюю полость объемом 14000 кубических анстрем, помещенную в липидный бислой. Большинство современных программ докинга используют в своих расчетах исключительно неявную форму водного раствора при расчете энергий связывания и не могут учитывать влияние липидного бислоя. Использование же статических структур ZMPSTE24, погруженных в бислой, не смогут учесть специфику карманов, образованных на интерфейсе фермент-липид-вода, а также их динамические характеристики – модель липидного слоя предполагает высокую подвижность гидрофобной части молекул бислоя в сравнении с устройством полостей и карманов структурно-стабильных белков. Сочетание этих факторов приводит к неэффективности и такого популярного метода поиска ингибиторов, как SAR-исследования (structure-activity relationship), приспособленные к моделям чистого водного растворителя. Наиболее рациональный путь в данном случае предполагает использование базовой структуры молекул, потенциал которых уже показан в экспериментах in vitro и in vivo, в качестве отправной точки для поиска модификаций, ввод которых обеспечит высокую эффективность связывания. На данный момент лучшим кандидатами являются синтетические пептидомиметики, применяемые при ингибировании аспартат протеаз, в т.ч. и ВИЧ протеазы. Для поиска механизма действия подобного класса молекул, который для ZMPSTE24 неизвестен до сих пор, нами был разработан in silico метод поиска сайтов связывания, а также пути доставки молекул из раствора, с учетом как интерфейса фермент-липиды-вода, так и самой динамической структуры фермента и окружающей мембраны. Метод основывается на применении моделирования молекулярной динамики в сочетании с расширенным методом метадинамики (см.ниже). Важность подхода обусловлена тем, что в литературе уже было попытка модификации структур пептидомиметиков ВИЧ протеазы, основанная на гипотезе общего механистического действия аспартат протеаз и цинк-зависимых растворимых протеаз. По аналогии механизм был предложен и для ZMPSTE24. При этом никакими структурными исследованиями эта гипотеза не была подтверждена. В ходе нашего исследования был обнаружен совершенно новый механизм действия пептидомиметиков ВИЧ протеаз, который открывает целый ряд особенностей и идей рационального дизайна эффективного ингибитора ZMPSTE24. Разработанный алгоритм был применен для установления распределения возможных конформационных состояний и типов связывания лопиновира относительно всей поверхности ZMPSTE24, погруженного в липидный бислой, а также в его внутренней полости и на удалении от поверхности в толщине раствора – как водного, так и липидного. Это обеспечило возможность энергетической оценки связывания лопиновира во всех потенциальных сайтах связывания, а также барьеров между ними и возможных путей миграции из внешнего растворителя. Подобные энергетический карты построены относительно трех координат фазового пространства и представлены в виде срезов на отдельных значениях одной из выбранной переменных и изоповерхностей (Рис. 1,2). Т.е. для интерпретации полученных многомерных энергетических карт удобно использовать фиксированные значения только одной переменной, например расстояния центра масс лопиновира от центра масс фермента, но прорисовывать распределения относительно других двух переменных – угловых θ и φ. Анализ показывает, что проникновение лопиновира из водного раствора в мембрану затруднительно ввиду наличия барьера. Данный барьер формируется в результате особенностей строения липидного бислоя: в сторону водного раствора ориентируются заряженные части составляющих мембрану фосфолипидов – фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, образующих дипольный поверхностный потенциал, который на первоначальном этапе прохождения лопиновира в мембрану обеспечивает барьер, как стерический, так и, возможно, энтропийный, наблюдаемый в системах липиды-вода. Т.к. лопинавир – гидрофобное соединение, то его попадание в липидный слой – выгодный процесс сам по себе. Однако путь концентрирования его в мембранах проходит через барьер, образованный дипольным поверхностным потенциалом. При этом возможно наблюдать, что проникновение лопинавира в мебрану энергетически более выгодно в области значений 60<θ<75 и -160<φ<-180. Эта область соответствует границе липидной мембраны с водным раствором над входом во внутреннюю полость ZMPSTE24, используемым белковым субстратом для проведения каталитического протеолиза. Детальное исследование этой области в процессе молекулярной динамики позволило выявить проседание липидного бислоя вблизи входа в активный центр фермента относительно общей поверхности мембраны (Рис.3). Подобное проседание обеспечивается специфическим распределением заряда на поверхности ZMPSTE24, показанное в ходе одного из этапов работы в 2017г. По всей видимости, мы предполагаем, что проседание формирует разрыв в дипольной части бислоя и облегчает доступ гидрофобных молекул к внутренней гидрофобной части мембраны. Однако, при этом, наименьшим значением энергии соответствует связывание лопинавира на интерфейсе, образованным входом в активный центр фермента и липидным бислоем (75<θ<100 и -160<φ<-180,160<φ<180). Несмотря на возможность проникновения лопиновира во внутреннюю полость фермента, специфического взаимодействия с остатками каталитического центра или областью связывания субстрата обнаружено не было (Рис. 1). Косвенно эти результаты подтверждаются отсутствием кристаллографической структуры ZMPSTE24 в комплексе с лопинавиром в активном центре. Обнаруженный нами механизм связывания также подтверждает и ингибирование лопинавиром фермента по конкурентному типу. Мы также провели подобное исследование в системе фермент-вода без липидного слоя. Подобного типа связывания обнаружено не было (Рис. 2). Это может объяснить отсутствие электронной плотности лопинавира в кристаллах ZMPSTE24, выращенных при добавлении ингибитора, ввиду отсутствия в кристаллах упорядоченной структуры мембраны. Для установления специфических взаимодействий лопинавира в процессе связывания на входе в активный центр мы провели кластерный анализ ансамбля структур ингибитора, обнаруженных в процессе его нахождения в обнаруженном нами центре связывания. Для этого был использован непараметрический байесовский метод кластеризации по основным двугранным углам, определяющим конформацию лопинавира (см. ниже). На предмет специфических взаимодействий был использован самый населенный кластер. Ориентация и конформация лопинавира характеризуется стэкинг-взаимодействием одной из боковых фенильных групп с фениаланиновым аминокислотным остатком фермента, обеспечивающих структуру петли на входе в активный центр, плотным контактном гидрофобных групп аминокислот образующих вход спиралей фермента с боковыми гидрофобными группами лопинавира. Также гидрофобные группировки лопинавира частично остаются в липидном бислое. Кетотетрагидропиримидиновая группировка лопинавира – наиболее полярная часть ингибитора – обращена во внутренню полость фермента, наполненную молекулами воды. Таким образом, мы предлагаем данный центр связывания, как наиболее перспективный с точки зрения связывания конкурентных ингибиторов пептидомиметиков, ввиду наличия как функционально важных заряженных и гидрофобных групп фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, так и особым способом доставки и проникновения в мембрану. В метадинамике к основному потенциалу системы добавляется смещающий гауссов потенциал от коллективных переменных через определенные промежутки времени (формула 1). Высота ω и ширина δs гауссова потенциала и частота τG добавления этого смещающего потенциала к полному потенциалу системы, а также выбор коллективных переменных (CV) являются важнейшими параметрами при таком моделировании. Для построения полной трехмерной карты свободной энергии лопинавира при движении относительно ZMPSTE24 мы должны были подобрать такие CV, который бы описывал этот процесс наиболее точно. Каждую точку на поверхности белка в системе координат связанной с центром масс белка можно задать тремя переменными: два сферических угла θ и φ и расстояние между центром масс белка и лиганда r (Рис. 4). ZMPSTE24 представляет собой мембранный белок, содержащий структуру из трансмембранных альфа-спиралей, образующих камеру внутри белка существенного объем. Поэтому выбор именно таких трех коллективных переменных позволяет исследовать внешнюю и внутреннюю поверхности белка, а также процесс проникновения лопинавира в камеру внутри фермента. Таким образом положение лиганда относительно центра масс белка описывалось обычными сферическими координатами, которые легко перерассчитывались из декартовых компонент радиус-вектора между белком и лигандом (формула 2). Значение ω для потенциала смещения равнялось 5 кДж/моль, ширина потенциалов δsθ и δsφ выбраны 0.1 радиан и 1Å для δsr. Такой выбор этих параметров позволил плавно исследовать всю поверхность свободной энергии. При движение лопинавира от одной точки поверхности белка к другой может быть энергетически выгодно его смещение в раствор. Однако отдаление на значительное расстояние может, с одной стороны, замедлить расчеты, а с другой внести артефакты, связанные с сильным изменением радиуса. Чтобы избежать сильного удаления лопиновира от белка было введено ограничение на координационное число. Координационное число позволяет количественно охарактеризовать степень близости лиганда к белку и рассчитывается по формуле 3. Само число состоит из слагаемых sij, которые равняются 1, если атом j, в данном случае, лиганда расположен не дальше, чем на расстоянии r0 от атома белка i (то есть образует «контакт»), и в любом другом случае равно нулю. Введения ограничения на координационное число позволяет, варьируя параметр r0, контролировать расстояние, на которое ингибитор может отходить от поверхности белка. Параметры для ограничения системы по координационному числу были подобраны в ходе ряда калибровочных запусков метадинамики таким образом, чтобы лиганд имел возможность отходить от белка на расстояние, на котором между ними может оказать растворитель, но при этом достаточно малое, чтобы в случае можно было почувствовать взаимодействие с поверхностью. При сильном отдалении лопиновира от белка средства программы для метадинамики вводят дополнительную энергию таким образом, чтобы сблизить их друг с другом. Это, без дополнительного контроля, может привести к тому, что белок может начать разрушаться. Так происходит потому, что при удалении ингибитора все меньше атомов белка будут находиться в контакте с ингибитором (Рис. 5), а это, в свою очередь, приведет к тому, что системе может оказаться более выгодным начать разрушение белка вместо того, чтобы двигать лиганд в сторону поверхности. Для предотвращения такого исхода дополнительно было введено ограничение значение RMSD всех атомов основной цепи белка. Такой выбор атомов для RMSD позволил предотвратить разрушение структуры фермента, но также не стал препятствием для свободного движения аминокислотных радикалов, которое может происходить в растворе, при взаимодействии с мембраной, а также при взаимодействии с ингибитором. Молекула лопинавира не является стандартной для атомных силовых полей. Точечные заряды на атомах были рассчитаны с применением процедуры RESP. Однако, лопинавир – достаточно большая молекула, поэтому для расчета зарядов он был логично разделен на три части, которые были параметризованы по отдельности (Рис. 6). Такой подход позволил избежать возможных артефактов при расчете заряда, в связи с наличием большего количества конформеров лопинавира. Кроме того, при дальнейшем поиске новых ингибиторов на основе лопинавира, можно будет легко заменять одну или две части молекулы, используя уже известные параметры для остальных константных частей. Параметры силового поля для атомов были выбраны в соответствии с атомным силовым полем GAFF (General Amber Force Field). Молекулярно механическая энергия итоговой молекулы была сопоставлена с квантовой энергией. Сравнение показало, что молекулярно механическая модель, рассчитанные точечные заряды и выбранные параметры поля с высокой степенью точности совпадает с квантовой. Кластеризацию цельной структуры субстрата проводили на базе значений дигедральных углов между углеводными мономерами, с использованием следующей модификации: Отображение фазового пространства углов – в общем случае L-мерного бокса Pc (формула 4). Продуктом отображения является тор Te – L-мерная поверхность на единичной сфере S2L-1. Отображение является локальной изометрией с сохранением меры расстояний. Преобразованные переменные использовали для кластеризации с помощью Байесовского непараметрического метода, имплементированного в программе dpMMlowVar. Оптимизацию углового параметра для данного метода проводили в пределах [-0.6;-0.3] с шагом 0.01 на основании оценочной функции силуэт. При визуализации результатов кластеризации использовали метод главных компонент для трансформированных значений углов с выделением первых трех главных компонент.

Ядерная ламина (ядерная пластинка) - жесткая фибриллярная белковая сеть, образованная белками-ламининами (промежуточными филаментами), подстилает ядерную мембрану, поддерживая ее. Она представляет собой фиброзный слой ядерной оболочки с поровыми комплексами. Связана с интегральными белками слоем, состоящим из переплетенных промежуточных филаментов (ламинов), образующих кариоскелет. К ламине прикреплены нити хромосомной ДНК, т.е. участвует в организации хроматина. Белки поровых комплексов структурно связаны с белками ядерной ламины, которая участвует в их организации. Таким образом, ламина играет очень важную роль в поддержании формы ядра, упорядоченной укладке хроматина, структурной организации поровых комплексов и формировании кариолеммы при делении клеток (дезинтеграция ядерной оболочки в профазе и интеграция в телофазе).

75.Хроматин. Хроматин – мелкие зернышки и глыбки, который обнаруживается в ядре клеток и хорошо воспринимает краситель (хромос), откуда и произошло его название. В химическом плане хроматин состоит из комплекса ДНК и белка (туда также входит РНК) и соответствует хромосомам, которые в интерфазном ядре представлены тонкими нитями и неразличимы как индивидуальные структуры. Хроматин – вещество хромосом. Хроматин состоит из хроматиновых фибрилл, которые могут располагаться в ядре рыхло или компактно. На этом основании различают два вида хроматина: эухроматин - рыхлый или деконденсированный (деспирализованный) хроматин, слабо окрашивается основными красителями и не виден в световой микроскоп, он доступен для транскрипции; гетерохроматин - компактный или конденсированный (спирализованный) хроматин, хорошо окрашивается этими же красителями и виден в световой микроскоп. При подготовке клетки к делению (интерфаза) в ядре происходит спирализация хроматиновых фибрилл и превращение хроматина в хромосомы. После деления в ядрах дочерних клеток происходит деспирализация хроматиновых фибрилл и хромосомы снова преобразуются в хроматин. Следовательно, хроматин и хромосомы представляют собой различные фазы одного и того же вещества. Таким образом, по морфологическим признакам ядра (по соотношению содержания эу- и гетерохроматина) можно оценить активномть процессов транскрипции (синтетическую функцию клетки).При ее повышении это соотношение изменяется в пользу эухроматина, и наоборот.При полном подавлении функции ядра (например, в поврежденных и гибнущих клетках, при ороговении эпителия) оно уменьшается в размерах, содержит только гетерохроматин и окрашивается основными красителями интенсивно и равномерно. Это явление – кариопикноз. Распределение гетерохроматина и соотношение содержания эу- и гетерохроматина характерны для клеток каждого типа, что позволяет осуществлять их идентификацию. Вместе с тем имеются общие закономерности распределения гетерохроматина в ядре: его скопления располагаются под кариолеммой, прерываясь в области пор (что обусловлено его связью с ламиной) и вокруг ядрышка. Более мелкие глыбки разбросаны по всему ядру. Тельце Бара – скопление гетерохроматина, соответствующее одной Х-хромосоме у особей женского пола, которая в интерфазе скручена и неактивна. В большинстве клеток оно лежит у кариолеммы, а в гранулоцитах крови имеет вид маленькой добавочной дольки ядра («барабанной палочки»). Выявление тельца Бара (обычно в эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта) используется как диагностический тест для определения генетического пола.

76.Диффузный и конденсированный хроматин (эу- и гетерохроматин).

Хроматин – мелкие зернышки и глыбки, который обнаруживается в ядре клеток и хорошо воспринимает краситель (хромос), откуда и произошло его название. В химическом плане хроматин состоит из комплекса ДНК, РНК и белка, где ДНК находится в разной степени конденчации, и соответствует хромосомам, которые в интерфазном ядре представлены тонкими нитями и неразличимы как индивидуальные структуры. Хроматин – вещество хромосом. Хроматин состоит из хроматиновых фибрилл, которые могут располагаться в ядре рыхло или компактно. На этом основании различают два вида хроматина: эухроматин - рыхлый или деконденсированный (деспирализованный) хроматин, слабо окрашивается основными красителями и не виден в световой микроскоп, он доступен для транскрипции; гетерохроматин - компактный или конденсированный (спирализованный) хроматин, хорошо окрашивается этими же красителями и виден в световой микроскоп. При подготовке клетки к делению (интерфаза) в ядре происходит спирализация хроматиновых фибрилл и превращение хроматина в хромосомы. После деления в ядрах дочерних клеток происходит деспирализация хроматиновых фибрилл и хромосомы снова преобразуются в хроматин. Следовательно, хроматин и хромосомы представляют собой различные фазы одного и того же вещества. Таким образом, по морфологическим признакам ядра (по соотношению содержания эу- и гетерохроматина) можно оценить активномть процессов транскрипции (синтетическую функцию клетки).При ее повышении это соотношение изменяется в пользу эухроматина, и наоборот.При полном подавлении функции ядра (например, в поврежденных и гибнущих клетках, при ороговении эпителия) оно уменьшается в размерах, содержит только гетерохроматин и окрашивается основными красителями интенсивно и равномерно. Это явление – кариопикноз. Распределение гетерохроматина и соотношение содержания эу- и гетерохроматина характерны для клеток каждого типа, что позволяет осуществлять их идентификацию. Вместе с тем имеются общие закономерности распределения гетерохроматина в ядре: его скопления располагаются под кариолеммой, прерываясь в области пор (что обусловлено его связью с ламиной) и вокруг ядрышка (перинуклеарно). Более мелкие глыбки разбросаны по всему ядру. Тельце Бара – скопление гетерохроматина, соответствующее одной Х-хромосоме у особей женского пола, которая в интерфазе скручена и неактивна. В большинстве клеток оно лежит у кариолеммы, а в гранулоцитах крови имеет вид маленькой добавочной дольки ядра («барабанной палочки»). Выявление тельца Бара (обычно в эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта) используется как диагностический тест для определения генетического пола.