Лавров заявил о росте риска применения ядерного оружия из-за действий сша. Ядерная ламина; структура и функции Всего один ген – и целая куча болезней

Результаты этапа: 1) Анализ содержания ламина А и ламина В в ядерной оболочке клеток отобранных на первом этапе работы линий (Ras-трансформированные фибробласты хомяка с разным метастатическим потенциалом). Во всех клеточных линиях антитела к обоим ламинам ярко окрашивают ядра. У клеток HET-SR (низкометастазирующие) ядра имеют правильную форму, ламин А выявляется и в ядерной оболочке, и в нуклеоплазме, ламин В ярче в основном присутствует в оболочке ядра. У всех высокометастазирующих линий клеток наблюдается большое разнообразие форм ядер, а также образование складок или неравномерных скоплений ламинов (рис. 1). У спонтанно трансформированных клеток, у которых трансформация произошла в результате длительного культивирования in vitro линии эмбриональных клеток сирийского хомяка (ST-HET – низкометастазирующие клетки, ST-HET клон 83/20 – высокометастазирующие клетки) наблюдались сходные изменения – при отсутствии достоверной разницы в интенсивности окрашивания ламинов А и В между низко- и высокометастатическими линиями была отмечена большая изменчивость форм ядер у высокометастатической линии ST-HET clone 83/20 и неравномерное распределение обоих ламинов (рис.2). Вестерн-блот-анализ экспрессии ламинов также не показал существенного различия в содержании ламинов А и В между низко и высокометастазирующими клетками (рис.3). Поскольку различия в метастатической активности in vivo могут зависеть от активности матриксных металлопротеаз, был проведен зимографический анализ в исследуемых линиях. Для этого рассаживали клетки на 35 мм чашки Петри в концентрации 150000 клеток на чашку, культивировали 1 сутки, потом 3 раза отмывали средой без сыворотки и оставляли в бессывороточной среде на 12 часов и собирали кондиционированную среду. После этого подсчитывали количество клеток в чашках для нормирования нанесения белка при исследовании активности металлопротеиназ. Для анализа желатиназной активности матриксных металлопротеаз 10 мкл аликвоты кондиционированной среды смешивали с 10 мкл буфера для нанесения белков для зимографии и наносили на гель. Проводился стандартный SDS-ПААГ электрофорез в стандартных условиях в 8% полиакриламидном геле, содержащем 0,2% желатина, осуществляли ренатурацию в течение 30 мин и проводили желатиназную реакцию в течение 4 часов. Для всех исследованных линий быявлялась активность металлопротеиназы 2, однако достоверных различий в активности металлопротеиназ между низко и высокометастатическими клетками обнаружено не было (рис.4). Таким образом, различия в метастатическом потенциале клеток сирийского хомяка при разных способах трансформации вызвано не изменением содержания ламина А или ламина В, но ассоциировано с изменением формы ядер и распределения ламинов, что указывает на возможные нарушения как в таргетинге ламинов во внутреннюю ядерную мембрану, так и в регуляции сборки микродоменов ламинов. 2) Анализ миграционной активности клеток в ограниченном пространстве. Миграционную активность клеток в зависимости от уровня экспрессии ламина А и его сплайс-вариантов проводили в камерах Бойдена с диаметром пор 3 и 8 мкм. Для создания градиента хемоаттрактанта в нижнюю камеру добавляли эмбриональную сыворотку, клетки в верхней камере инкубировали в бессывороточной среде (рис.5). Анализ проводили на клеточных популяциях линии HT1080 (фибросаркома человека), гетерогенных по уровню экспрессии GFP-ламина А и GFP-прогерина, а также клетках с нокдауном ламина А (уровень нокдауна в индивидуальных клетках пропорционален флуоресценции GFP, коэкспрессирующегося со шпилечной РНК против ламина А). Анализ эффективности миграции осуществляли на следующие сутки после посева при помощи высокопроизводительного микроскопического скрининга и автоматической детекции количества клеток с надпороговым уровнем сигнала GFP с обеих сторон мембраны с использованием алгоритмов, оптимизированных на предыдущем этапе выполнения проекта. Результаты анализа показали, что доля клеток, экспрессирующих как экзогенный ламин А, так и прогерин, существенно снижена в популяции клеток, мигрировавших через поры, что свидетельствует о торможении миграции (рис.6). Данный эффект зависит от размера пор: эффективность миграции через 8-мкм поры снижается на 25% и 32% для ламина А и прогерина, соотвественно, а при миграции через 3-мкм поры, эффективность снижалась еще существеннее - на 61% и 66%. В то же время подавление экспрессии ламина А не приводит к активации миграции (рис.7). По-видимому, поскольку в данных исследованиях использовались трансформированные клетки с изначально высоким миграционным потенциалом и высокой пластичностью ядерной оболочки, дополнительное снижение уровня ламина А не вносит существенного вклада в способность клеток мигрировать через поры. Поэтому на следующем этапе экспериментов планируется использовать описанные в предыдущем отчете линии HSR, демонстрирующие разные возможности к метастазированию (инвазии в ткани организма), а также их трансгенные варианты. 3). Для исследования миграции клеток в 3D коллагеновом геле совместно в компанией PhaseView был разработан оптимизированный алгоритм регистрации изображений методом микроскопии планарного освещения (SPIM). Данный алгоритм и его аппаратная имплементация обеспечивают трехмерную световую микроскопию планарного освещения (SPIM) с лазерным световым листом с повышенной однородностью и глубиной распространения по всему полю зрения в прозрачных и полупрозрачных образцах от среднего до крупного размера. В частности, в этой системе предусмотрены средства для поддержания минимальной толщины лазерного светового листа внутри объекта на максимально возможной для данной оптической конфигурации площади, что обеспечивает равномерное и максимально возможное аксиальное разрешение по всему полю зрения. В основе системы лежит синхронизация скорости и фазы Rolling shutter КМОП-камеры, используемой для регистрации изображений, с перемещением седловины лазерного листа при помощи адаптивной оптики, установленной в оптическом пути возбуждения (рис. 8). Система была специально адаптирована для анализа миграции клеток в трехмерном геле, поскольку SPIM-микроскопия обеспечивает пониженную фототоксичность и существенно более высокую скорость захвата изображения по сравнению с лазерной конфокальной микроскопией с поточечным сканированием, что позволяет проводить длительные прижизненные наблюдения, анализируя при этом существенно больший объем образца с высоким пространственным и временным разрешением (рис.9). Данная система будет в дальнейшем использована для анализа влияния ингибирования Zmpste24 на миграционную активность раковых клеток в 3D-гелях. 4) Влияние экспрессии экзогенных ламина А и прогерина на механические свойства ядерной оболочки в живых клетках анализировали при помощи сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM). Данный метод, помимо возможности высокоскоростного сканирования рельефа поверхности живых культивируемых клеток с высоким латеральным и аксиальным разрешением, позволяет измерять эластические свойства клеток (рис.10а,б). Измерение коэффициентов упругости ядра также возможно благодаря незначительному по толщине слою цитоплазмы над ядром клетки, распластанной на стеклянной подложке. Для минимизации вклада цитоплазмы в определяемые параметры ядра использовались клетки фибросаркомы человека HT1080, демонстрирующие высокую степень распластывания. Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-ламин А или GFP-прогерин. Измерения проводили на приборе МНТ (ООО «Медицинские нанотехнологии»), установленном на инвертированной флуоресцентной платформе Eclipse Ti2 (Nikon) на второй день после трансфекции. В качестве сканирующего элемента использовались стеклянная микропипетка на пьезоконтроллере (Рис. 10,а). Клетки для сканирования выбирали по уровню флуоресценции в канале GFP. Сначала проводили сканирование рельефа исследуемой клетки. В данном случае детекция поверхности происходит, когда при достижении ее границы стеклянной микропипеткой сила ионного тока падает на ~0,25-1%. Далее осуществлялось определение эффективной жесткости, вычисляемое из регистрируемого конечного смещения мембраны после продавливания ее ионным током, при этом определяется следующая точка падения ионного тока на ~1%. Клетка сканировалась целиком, далее определялось положение ядра по самой высокой точке на рельефе. В этой области для обработки брались 10 точек, значение жесткости для еще 10 точек выбирались по периферии клетки, при этом эти точки не должны были находиться совсем вблизи края цитоплазмы, чтобы в выборку не попали значения жесткости подложки (рис. 10,в). Результаты измерений упругости ядра нормировали на упругость цитоплазмы в области ламеллы. В ряде экспериментов измерения проводили на фоне разборки актинового и тубулинового цитоскелета (под действием нокодазола и цитохалазина D), степень разборки оценивали при помощи иммуноокрашивания клеток антителами против бета-тубулина или прижизненной окраски SIR-актином. Предварительные результаты показали прямую корреляцию между концентрацией экзогенного GFP-ламина А в ядре и жесткостью клеточного ядра (рис.11). Исследования будут продолжены для оптимизации метода (подбор диаметра капилляра, модификация алгоритмов расчета жесткости и т. д.) с целью повышения точности измерений, увеличения размеров выборки, а также для исследования эффективности ингибиров Zmpste24. 5). Исследование влияния экспрессии прогерина на структурную организацию и позиционирование периферического гетерохроматина проводили на модели клеточных линий китайского хомячка (CHO), в геном которых бы интегрирован искусственный хромосомный локус, содержащий множественные тандемные повторы Lac-оператора. Визуализацию локусов осуществляли при помощи экспрессируемого в клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al, 1996). В работе использовали клон AO_3, содержащий амплифицированный искусственный локус (HSR), демонстрирующий высокую степень гетерохроматинизации и перманентно ассоциированный с ядерной ламиной (Li et al, 1998; Жиронкина и др., 2014). Клетки CHO AO_3 трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-прогерин, через 48 часов клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против ламина А для дифференцирования сигналов GFP-Lac-репрессора и GFP-прогерина. Иммунофлуоресцентная микроскопия и микроскопия с суперразрешением показали, что экспрессия прогерина не вызывает уменьшения степени компактизации, оцениваемого по изменениям площади HSR или средней интенсивности флуоресценции GFP в нем (рис. 12). Также не наблюдалось значительных изменений в позиционировании HSR относительно ядерной оболочки: в клетках с высоким уровнем экспрессии прогерина выявляется типичная для прогерии Хатчисона-Джилфорда лобулярная структура ядра и образование многочисленных инвагинаций ядерной оболочки, и HSR всегда остается ассоциированным либо с ядерной периферией, либо с ламинов в области инвагинаций. Для исследования ультраструктурной организации хроматина в клетках, экспрессирующих GFP-прогерин, была использована иммуноэлектронная микроскопия с антителами против GFP с последующей Ag-амплификацией сигнала вторичных Nanogold-меченых антител. Такой подход позволил идентифицировать трансфицированные клетки на светооптическом уровне в при помощи светлопольной оптической микроскопии и эффективно находить их на ультратонких срезах. Эдектронно-микроскопический анализ показал, что как искусственные хромосомные локусы, так и эндогенные гетерохроматические района хромосом, вопреки высказанным ранее гипотезам, сохраняют свою конденсированную структуру. Однако при этом часто наблюдается утрата ассоциации периферического гетерохроматина с ядерной ламиной и перемещение его во внутренние районы ядра (Рис. 13, а). Значительные участки ядерной ламины в этих условиях остаются свободными от контактов с гетерохроматином (рис.14). 6). Выявление круга наиболее перспективных конкурентных ингибиторов при использовании методов молекулярного моделирования, дальнейшее изучение стабильности фермент-ингибиторных комплексов методами молекулярной динамики с целью отбора кандидатных соединений для экспериментального исследования Для ZMPSTE24 структурная информация определена кристаллографическими данными рекомбинантного человеческого фермента и белка из Saccharomyces cerevisiae Ste24p. При этом известна только одна структура комплекса ZMPSTE24 с одним из ингибиторов растворимых цинк-зависимых металлопротеаз, обеспечивающих слабое конкурентное ингибирование ZMPSTE24, – фосфарамидоном, характеризующаяся низкими показателями разрешения кристаллографического метода. Несмотря на схожесть активного центра ZMPSTE24 с некоторыми цинк-зависимыми металлопротеазами, как например термолизин и неприлизин, связывание фосфорамидона обеспечивалось на значительно более низком уровне. Т.к. эксперименты проводились in vitro прямых доказательств эффективности данного класса ингибиторов в качестве лекарств не выявлено. Ожидание эффективности действия in vivo на данный момент не подкреплено какими-либо методами, более того, доставка подобных соединений может быть затруднена сложным входом в активный центр ZMPSTE24, образованным интерфейсом взаимодействия фермент-липид-вода, как было описано нами в ходе предыдущего этапа работы в 2017 году. С другой стороны, обнаружено, что класс молекул, применяемых в антиретровирусной терапии пациентов с ВИЧ, может вызывать у них липодистрофию, как результат нецелевого связывания этих молекул с ZMPSTE24. При этом наиболее эффективным образом показал себя лопиновир, для которого экспериментально показан конкурентный механизм ингибирования ZMPSTE24. Ввиду описанных ограничений применение классической схемы in silico скрининга библиотек химических соединений, как правило, представляющей собой перебор большого количества случайных или синтезированных на данный момент структур органических молекул и их последующий докинг в статическую кристаллографическую структуру ZMPSTE24, видится малоэффективным. Структура ZMPSTE24 представляет собой довольно уникальную форму, образованную семи трансмембранными спиралями, охватывающими заполненную водой внутреннюю полость объемом 14000 кубических анстрем, помещенную в липидный бислой. Большинство современных программ докинга используют в своих расчетах исключительно неявную форму водного раствора при расчете энергий связывания и не могут учитывать влияние липидного бислоя. Использование же статических структур ZMPSTE24, погруженных в бислой, не смогут учесть специфику карманов, образованных на интерфейсе фермент-липид-вода, а также их динамические характеристики – модель липидного слоя предполагает высокую подвижность гидрофобной части молекул бислоя в сравнении с устройством полостей и карманов структурно-стабильных белков. Сочетание этих факторов приводит к неэффективности и такого популярного метода поиска ингибиторов, как SAR-исследования (structure-activity relationship), приспособленные к моделям чистого водного растворителя. Наиболее рациональный путь в данном случае предполагает использование базовой структуры молекул, потенциал которых уже показан в экспериментах in vitro и in vivo, в качестве отправной точки для поиска модификаций, ввод которых обеспечит высокую эффективность связывания. На данный момент лучшим кандидатами являются синтетические пептидомиметики, применяемые при ингибировании аспартат протеаз, в т.ч. и ВИЧ протеазы. Для поиска механизма действия подобного класса молекул, который для ZMPSTE24 неизвестен до сих пор, нами был разработан in silico метод поиска сайтов связывания, а также пути доставки молекул из раствора, с учетом как интерфейса фермент-липиды-вода, так и самой динамической структуры фермента и окружающей мембраны. Метод основывается на применении моделирования молекулярной динамики в сочетании с расширенным методом метадинамики (см.ниже). Важность подхода обусловлена тем, что в литературе уже было попытка модификации структур пептидомиметиков ВИЧ протеазы, основанная на гипотезе общего механистического действия аспартат протеаз и цинк-зависимых растворимых протеаз. По аналогии механизм был предложен и для ZMPSTE24. При этом никакими структурными исследованиями эта гипотеза не была подтверждена. В ходе нашего исследования был обнаружен совершенно новый механизм действия пептидомиметиков ВИЧ протеаз, который открывает целый ряд особенностей и идей рационального дизайна эффективного ингибитора ZMPSTE24. Разработанный алгоритм был применен для установления распределения возможных конформационных состояний и типов связывания лопиновира относительно всей поверхности ZMPSTE24, погруженного в липидный бислой, а также в его внутренней полости и на удалении от поверхности в толщине раствора – как водного, так и липидного. Это обеспечило возможность энергетической оценки связывания лопиновира во всех потенциальных сайтах связывания, а также барьеров между ними и возможных путей миграции из внешнего растворителя. Подобные энергетический карты построены относительно трех координат фазового пространства и представлены в виде срезов на отдельных значениях одной из выбранной переменных и изоповерхностей (Рис. 1,2). Т.е. для интерпретации полученных многомерных энергетических карт удобно использовать фиксированные значения только одной переменной, например расстояния центра масс лопиновира от центра масс фермента, но прорисовывать распределения относительно других двух переменных – угловых θ и φ. Анализ показывает, что проникновение лопиновира из водного раствора в мембрану затруднительно ввиду наличия барьера. Данный барьер формируется в результате особенностей строения липидного бислоя: в сторону водного раствора ориентируются заряженные части составляющих мембрану фосфолипидов – фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, образующих дипольный поверхностный потенциал, который на первоначальном этапе прохождения лопиновира в мембрану обеспечивает барьер, как стерический, так и, возможно, энтропийный, наблюдаемый в системах липиды-вода. Т.к. лопинавир – гидрофобное соединение, то его попадание в липидный слой – выгодный процесс сам по себе. Однако путь концентрирования его в мембранах проходит через барьер, образованный дипольным поверхностным потенциалом. При этом возможно наблюдать, что проникновение лопинавира в мебрану энергетически более выгодно в области значений 60<θ<75 и -160<φ<-180. Эта область соответствует границе липидной мембраны с водным раствором над входом во внутреннюю полость ZMPSTE24, используемым белковым субстратом для проведения каталитического протеолиза. Детальное исследование этой области в процессе молекулярной динамики позволило выявить проседание липидного бислоя вблизи входа в активный центр фермента относительно общей поверхности мембраны (Рис.3). Подобное проседание обеспечивается специфическим распределением заряда на поверхности ZMPSTE24, показанное в ходе одного из этапов работы в 2017г. По всей видимости, мы предполагаем, что проседание формирует разрыв в дипольной части бислоя и облегчает доступ гидрофобных молекул к внутренней гидрофобной части мембраны. Однако, при этом, наименьшим значением энергии соответствует связывание лопинавира на интерфейсе, образованным входом в активный центр фермента и липидным бислоем (75<θ<100 и -160<φ<-180,160<φ<180). Несмотря на возможность проникновения лопиновира во внутреннюю полость фермента, специфического взаимодействия с остатками каталитического центра или областью связывания субстрата обнаружено не было (Рис. 1). Косвенно эти результаты подтверждаются отсутствием кристаллографической структуры ZMPSTE24 в комплексе с лопинавиром в активном центре. Обнаруженный нами механизм связывания также подтверждает и ингибирование лопинавиром фермента по конкурентному типу. Мы также провели подобное исследование в системе фермент-вода без липидного слоя. Подобного типа связывания обнаружено не было (Рис. 2). Это может объяснить отсутствие электронной плотности лопинавира в кристаллах ZMPSTE24, выращенных при добавлении ингибитора, ввиду отсутствия в кристаллах упорядоченной структуры мембраны. Для установления специфических взаимодействий лопинавира в процессе связывания на входе в активный центр мы провели кластерный анализ ансамбля структур ингибитора, обнаруженных в процессе его нахождения в обнаруженном нами центре связывания. Для этого был использован непараметрический байесовский метод кластеризации по основным двугранным углам, определяющим конформацию лопинавира (см. ниже). На предмет специфических взаимодействий был использован самый населенный кластер. Ориентация и конформация лопинавира характеризуется стэкинг-взаимодействием одной из боковых фенильных групп с фениаланиновым аминокислотным остатком фермента, обеспечивающих структуру петли на входе в активный центр, плотным контактном гидрофобных групп аминокислот образующих вход спиралей фермента с боковыми гидрофобными группами лопинавира. Также гидрофобные группировки лопинавира частично остаются в липидном бислое. Кетотетрагидропиримидиновая группировка лопинавира – наиболее полярная часть ингибитора – обращена во внутренню полость фермента, наполненную молекулами воды. Таким образом, мы предлагаем данный центр связывания, как наиболее перспективный с точки зрения связывания конкурентных ингибиторов пептидомиметиков, ввиду наличия как функционально важных заряженных и гидрофобных групп фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, так и особым способом доставки и проникновения в мембрану. В метадинамике к основному потенциалу системы добавляется смещающий гауссов потенциал от коллективных переменных через определенные промежутки времени (формула 1). Высота ω и ширина δs гауссова потенциала и частота τG добавления этого смещающего потенциала к полному потенциалу системы, а также выбор коллективных переменных (CV) являются важнейшими параметрами при таком моделировании. Для построения полной трехмерной карты свободной энергии лопинавира при движении относительно ZMPSTE24 мы должны были подобрать такие CV, который бы описывал этот процесс наиболее точно. Каждую точку на поверхности белка в системе координат связанной с центром масс белка можно задать тремя переменными: два сферических угла θ и φ и расстояние между центром масс белка и лиганда r (Рис. 4). ZMPSTE24 представляет собой мембранный белок, содержащий структуру из трансмембранных альфа-спиралей, образующих камеру внутри белка существенного объем. Поэтому выбор именно таких трех коллективных переменных позволяет исследовать внешнюю и внутреннюю поверхности белка, а также процесс проникновения лопинавира в камеру внутри фермента. Таким образом положение лиганда относительно центра масс белка описывалось обычными сферическими координатами, которые легко перерассчитывались из декартовых компонент радиус-вектора между белком и лигандом (формула 2). Значение ω для потенциала смещения равнялось 5 кДж/моль, ширина потенциалов δsθ и δsφ выбраны 0.1 радиан и 1Å для δsr. Такой выбор этих параметров позволил плавно исследовать всю поверхность свободной энергии. При движение лопинавира от одной точки поверхности белка к другой может быть энергетически выгодно его смещение в раствор. Однако отдаление на значительное расстояние может, с одной стороны, замедлить расчеты, а с другой внести артефакты, связанные с сильным изменением радиуса. Чтобы избежать сильного удаления лопиновира от белка было введено ограничение на координационное число. Координационное число позволяет количественно охарактеризовать степень близости лиганда к белку и рассчитывается по формуле 3. Само число состоит из слагаемых sij, которые равняются 1, если атом j, в данном случае, лиганда расположен не дальше, чем на расстоянии r0 от атома белка i (то есть образует «контакт»), и в любом другом случае равно нулю. Введения ограничения на координационное число позволяет, варьируя параметр r0, контролировать расстояние, на которое ингибитор может отходить от поверхности белка. Параметры для ограничения системы по координационному числу были подобраны в ходе ряда калибровочных запусков метадинамики таким образом, чтобы лиганд имел возможность отходить от белка на расстояние, на котором между ними может оказать растворитель, но при этом достаточно малое, чтобы в случае можно было почувствовать взаимодействие с поверхностью. При сильном отдалении лопиновира от белка средства программы для метадинамики вводят дополнительную энергию таким образом, чтобы сблизить их друг с другом. Это, без дополнительного контроля, может привести к тому, что белок может начать разрушаться. Так происходит потому, что при удалении ингибитора все меньше атомов белка будут находиться в контакте с ингибитором (Рис. 5), а это, в свою очередь, приведет к тому, что системе может оказаться более выгодным начать разрушение белка вместо того, чтобы двигать лиганд в сторону поверхности. Для предотвращения такого исхода дополнительно было введено ограничение значение RMSD всех атомов основной цепи белка. Такой выбор атомов для RMSD позволил предотвратить разрушение структуры фермента, но также не стал препятствием для свободного движения аминокислотных радикалов, которое может происходить в растворе, при взаимодействии с мембраной, а также при взаимодействии с ингибитором. Молекула лопинавира не является стандартной для атомных силовых полей. Точечные заряды на атомах были рассчитаны с применением процедуры RESP. Однако, лопинавир – достаточно большая молекула, поэтому для расчета зарядов он был логично разделен на три части, которые были параметризованы по отдельности (Рис. 6). Такой подход позволил избежать возможных артефактов при расчете заряда, в связи с наличием большего количества конформеров лопинавира. Кроме того, при дальнейшем поиске новых ингибиторов на основе лопинавира, можно будет легко заменять одну или две части молекулы, используя уже известные параметры для остальных константных частей. Параметры силового поля для атомов были выбраны в соответствии с атомным силовым полем GAFF (General Amber Force Field). Молекулярно механическая энергия итоговой молекулы была сопоставлена с квантовой энергией. Сравнение показало, что молекулярно механическая модель, рассчитанные точечные заряды и выбранные параметры поля с высокой степенью точности совпадает с квантовой. Кластеризацию цельной структуры субстрата проводили на базе значений дигедральных углов между углеводными мономерами, с использованием следующей модификации: Отображение фазового пространства углов – в общем случае L-мерного бокса Pc (формула 4). Продуктом отображения является тор Te – L-мерная поверхность на единичной сфере S2L-1. Отображение является локальной изометрией с сохранением меры расстояний. Преобразованные переменные использовали для кластеризации с помощью Байесовского непараметрического метода, имплементированного в программе dpMMlowVar. Оптимизацию углового параметра для данного метода проводили в пределах [-0.6;-0.3] с шагом 0.01 на основании оценочной функции силуэт. При визуализации результатов кластеризации использовали метод главных компонент для трансформированных значений углов с выделением первых трех главных компонент.

Разрыв Договора о ракетах средней и меньшей дальности (ДРСМД) повысит риск начала ядерного конфликта, заявил Сергей Лавров. По словам главы МИДа, Россия ответит на выход США из соглашения военно-техническими средствами

Сергей Лавров (Фото: Владимир Астапкович / РИА Новости)

Выступая в университете в столице Киргизии, глава российского внешнеполитического ведомства прокомментировал решение Вашингтона начать выход из ДРСМД, сообщает «РИА Новости» . По словам министра, речь идет наступлении новой эпохи, когда США «взяли курс на слом всей системы контроля над вооружениями».

Упоминал Лавров и о планах Соединенных Штатов по созданию ядерных боеприпасов малой мощности. По его словам, все это понизит порог применения ядерного оружия и повысит риски возникновения конфликта.

Российский министр предположил, что результатом случившегося станут развитие холодной войны и гонка вооружений. Однако Москва будет реагировать на возникающие угрозы «военно-техническими средствами».

Что касается перспектив российско-американского диалога по стратегической стабильности, Лавров выразил надежду, что «Соединенные Штаты дозреют до понимания своей ответственности за создаваемые их политикой проблемы. «Тогда милости просим, двери открыты, будем разговаривать на равных, на основе учета законных интересов друг друга, а не выдуманных», — сказал министр.

Россия ответила на действия американских властей . Президент Владимир Путин объявил о приостановке участия в договоре на встрече с Лавровым и министром обороны Сергеем Шойгу. При этом глава государства подчеркнул, что Россия не намерена втягиваться в затратную для Москвы гонку вооружений.

Поводом для решения США стала российская крылатая ракета ​9М729, запуск которой осуществляется с помощью пусковых установок «Искандер-М». Американские власти потребовали приостановить разработку этой ракеты, обвинив Россию в нарушении ДРСМД. В Москве эти обвинения отрицают. Сергей Лавров заявил, что американская сторона начала нарушать договор с 1999 года, когда США начали испытывать боевые беспилотные летательные аппараты.

Договор о ракетах средней и меньшей дальности был подписан между США и СССР в 1987 году. Он запрещает испытывать, производить и ставить на вооружение ракеты наземного базирования меньшей (от 500 до 1 тыс. км) и средней дальности (от 1 тыс. до 5,5 тыс. км). Стороны обязались также в течение трех лет после подписания ДРСМД уничтожить уже стоявшие на вооружении подобные ракетные комплексы. Выход из договора позволяет вернуться к разработке и производству такого вооружения.

Введение . Впоследние годы в связи с успехами молекулярной генетики, приведшими к картированию и идентификации генов значительного числа моногенных наследственных заболеваний, стали возникать трудности в создании их классификационной структуры. Например, мутации в одном и том же гене могут привести как к проявлению различных по тяжести клинических форм одного заболевания (аллельная гетерогенность), так и к возникновению различных по клиническим проявлениям нозологических форм (так называемые «аллельные серии»). Одной из групп заболеваний, составляющих аллельные серии, являются ламинопатии . Они обусловлены мутациями в гене LMNA, приводящими к изменению структуры и функции белка ламина А/С (ламинопатии - заболевания, развивающиеся в результате мутаций в генах белков ядерной ламины – см. далее).

Известно, что оболочка клеточных ядер включает три основных компонента (см. рисунок): [1 ] наружную мембрану, [2 ] внутреннюю мембрану и [3 ] лежащую под ней тонкую ядерную пластинку – ядерную ламину (пластинка: лат. - lamina), образованную белковыми комплексами, в состав которых входят различные группы ламинов (ламиновые белки – см. далее). Нити ламинов образуют параллельные сверхскрученные димеры, которые, полимеризуясь, формируют волокнистую сеть на нуклеплазматической стороне внутренней ядерной мембраны, являясь якорем для мультипротеиновых комплексов как внутренней, так и внешней ядерной мембраны (обратите внимание: ламины относятся к 5 классу промежуточных филаментов, присутствующих во всех эукариотических клетках, т.е. во всех клетках имеющих оформленное ядро).

Таким образом, ламины - это структурные белки (имеют массу 60 - 89 кДа), компоненты ядерной ламины (nuclear lamina) - белковой сети, которая лежит под внутренней мембраной ядра и определяет его размер и форму (т.е. участвует в механическом сцеплении и взаимодействии белков нуклеоскелета и цитоскелета). Ядерная ламина обеспечивает прочность ядерной оболочки и организацию ядерных пор, противостоит силам деформации и защищает хроматин от физических повреждений. Как показывают исследования последних лет, наряду с выполнением структурной функции, ламины принимают участие в контроле репликации ДНК, организации хроматина и в регуляции генной экспрессии, процессинга и апоптоза.

Как было указано выше, ядерная ламина состоит из ламиновых белков - четырех: A, B1, B2 и C. Ламины В1, В2 (их также называют ламинами В-типа) кодируются двумя генами, LMNB1 и LMNB2 (локализованных в хромосомах 5q23 и 19q13 соответственно) и синтезируются во всех клетках многоклеточных животных. Ламины А и С (так называемые ламины А-типа [или ламин А/С]) являются продуктами альтернативного сплайсинга одного гена LMNA (локализованного в первой хромосоме 1q21.2-q21.3 и состоящего из 12 экзонов) и обнаруживаются в сравнимых количествах в дифференцированных тканях всех позвоночных, в т.ч. человека.

читайте также пост: Номенклатура хромосом человека (на сайт)

Обратите внимание ! Исследования последних лет дают основание считать ламины одними из основных белков, обеспечивающих синхронность протекания распада и восстановления ядерной мембраны в процессе клеточного деления. Показано, что в профазе клеточного деления происходит фосфорилирование ламинов, приводящее к их распаду, что является сигналом к разрушению ядерной оболочки. В противоположность этому в телофазе происходит дефосфорилирование ламинов, приводящее к их агрегации. Считается, что процесс реполяризации ламинов стимулирует восстановление ядерной оболочки. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что в профазе клеточного цикла сохраняется связь ламинов с фрагментами распавшейся ядерной мембраны и они являются своеобразной «меткой» для фрагментов ядерной оболочки при ее восстановлении.

Таким образом, основными функциями ламинов являются: [1 ] 1лючевая роль в поддержании формы и целостности ядерной оболочки; [2 ] организация хроматина и распределение ядерных пор; [3 ] пространственная организация процессов репликации и транскрипции ДНК, митотических событий и апоптоза; [4 ] участие в различных сигнальных путях; [5 ] организация генома.

Мутации гена LMNA ответственны за развитие более десятка заболеваний, именуемых ламинопатиями, затрагивающих различные ткани как изолированно (скелетные мышцы и миокард, жировую ткань, периферические нервы), так и системно (синдром преждевременного старения). Отмечаются также и перекрывающиеся фенотипы. Наряду с широкой клинической вариабельностью, также характерна выраженная генетическая гетерогенность.

Обратите внимание ! К настоящему времени показано, что мутации в гене LMNA (кодирующего ламины А-типа [ламин А/С]) являются этиологическим фактором 11 (! ) самостоятельных нозологических форм, входящих в состав пяти групп наследственных болезней – прогрессирующих мышечных дистрофий, дилятационных кардиомиопатий, липодистрофий, наследственных моторно-сенсорных нейропатий и синдромов преждевременного старения. Наиболее часто мутации в гене LMNA приводят к поражению скелетных мышц, миокарда и жировой ткани, значительно реже они являются этиологическим фактором прогероидных синдромов, наследственных нейропатий и летальной рестриктивной дермопатии. При этом, вышеуказанные синдромы могут вызываться мутациями как в генах собственно ламинов, так и в генах белков-партнеров (SREBP1, эмерины) и ферментов, участвующих в процессинге ламинов.

примечание: МД ЭД - мышечная дистрофия Эмери-Дрейфусса; КП МД - конечностно-поясная мышечная дистрофия; МД - мышечная дистрофия; ДКМП - дилатационная кардиомиопатия; КМП - кардиомиопатия; АД - аутосомно-доминантное наследование; АР - аутосомно-рецессивное наследование

Точный механизм развития ламин-ассоциированных заболеваний до сих пор еще детально не изучен. Доминируют две основные гипотезы, объясняющие наблюдаемые патологические фенотипы: структурная гипотеза и гипотеза «генной экспрессии». Согласно первой, недостаток ламинов или некорректная сборка мутантных ламиновых белков приводит к снижению прочности ядерной ламины и повышению уязвимости ядра и клетки в целом. Прежде всего при этом страдают клетки, подвергающиеся механическому стрессу, такие как мышечные клетки и кардиомиоциты, с развитием дегенеративных изменений. Вторая гипотеза предполагает нарушение взаимосвязи между ядерной ламиной и факторами транскрипции. Недавно была сформулирована еще одна гипотеза, согласно которой мутация ламинов A/C или отсутствие ламинов А-типа могут провоцировать третий механизм патогенеза - временную декомпартментализацию (из-за нарушения целостности ядерной мембраны), приводящую к неадекватному обмену между ядерными и цитоплазматическими компонентами.

Подробнее о ламин-ассоциированных заболеваниях в следующих источниках :

статья «Клинико-генетическая характеристика наследственных ламинопатий» Е.Л. Дадали, Д.С. Билева, И.В. Угаров; Медико-генетический НЦ РАМН, Москва; Кафедра генетики медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета, Москва (журнал «Анналы клинической и экспериментальной неврологии» №4, 2008) [читать ];

статья «Мутации гена ламина A/C (LMNA) у пацентов с дилатационной кардиомиопатией и их фенотипические проявления» Вайханская Т.Г., Сивицкая Л.Н., Даниленко Н.Г., Курушко Т.В., Давыденко О.Г.; Республиканский научно-практический центр «Кардиология», функциональная группа клинической патофизиологии кровообращения, г. Минск, Беларусь; Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии», Национальная академия наук, лаборатория нехромосомной наследственности, г. Минск, Беларусь (Евразийский кардиологический журнал, №1, 2016) [читать ];

диссертация на соискание ученой степени к.м.н. «Клинико-генетическое разнообразие и молекулярная диагностика мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса» Адян Тагуи Аветиковна, ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», Москва, 2015 [читать ];

презентация «Прогерия - Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS)» С. Кокорин, E. Подхалюзина, В. Смирнов; Семинар по молекулярной биологии; 25.12.2010 (bioinformaticsinstitute.ru) [читать ];

статья «Семейная парциальная липодистрофия (синдром Dunnigan) вследствие мутации в гене LMNA: первое описание клинического случая в России» Е.Л. Соркина, М.Ф. Калашникова, Г.А. Мельниченко, А.Н. Тюльпаков; Кафедра эндокринологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва; ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва (журнал «Терапевтический архив» №3, 2015) [читать ]

© Laesus De Liro